OBSERVACIÓN Y RECUENTO DE ESPERMATOZOIDES DE CONEJO

1. INTRODUCCIÓN TEÓRICA

Los espermatozoides son células haploides, con la mitad de ADN que el resto de células del organismo, es decir, con cromosomas sin homólogos. Producidos en los animales con reproducción sexual de sexo masculino, los espermatozoides, junto con los óvulos, participan en la fecundación, en el interior o exterior del organismo. La fecundación da lugar a un cigoto diploide, ya que junta el material genético del óvulo y el espermatozoide a partir de los cuales se ha formado. Este cigoto se divide por mitosis (el material genético es igual en todas las células) hasta ser un embrión.

Los espermatozoides son creados a partir de las espermatogonias, células presentes en los testículos (en mamíferos en concreto en un túbulo llamado epidídimo). Cada espermatogonia se somete a un proceso de meiosis y diferenciación, llamado espermatogénesis. En la primera división meiótica de la espermatogonia, esta da lugar a dos células diploides. En cada una de estas células, antes de la segunda división meiótica, los genes se recombinan, es decir, los cromosomas se intercambian partes para aumentar la variabilidad genética. La segunda división meiótica (donde no hay duplicación del ADN y se obtienen dos células haploides a partir de una diploide) y la fase de diferenciación dan lugar a cuatro espermatozoides a partir de una espermatogonia.

Los espermatozoides presentan la siguiente estructura:

El acrosoma contiene enzimas que rompen la membrana pelúcida del óvulo, con el fin de penetrar en él y formar el cigoto. Ya que ningún espermatozoide más puede entrar a causa de la formación de la membrana de fecundación por la rotura de los granos corticales del óvulo, el espermatozoide que ha entrado primero fusiona su material genético con el del óvulo, dando lugar al cigoto, célula diploide (con cromosomas homólogos cuando la cromatina se condense). Todos los orgánulos del cigoto los aporta el óvulo, excepto los centríolos, aportados por el espermatozoide.

El flagelo permite el movimiento en el plasma seminal, fluido producido por la próstata y la vesícula seminal, y rico en fructosa, que nutre a los espermatozoides. Estos obtienen energía gracias al aprovechamiento de este monosacárido en las mitocondrias, ubicadas en la pieza intermedia. Las células reproductoras masculinas junto con el plasma seminal forman el semen.

En ocasiones, el citoplasma libera unas gotas citoplasmáticas que circulan por el exterior del flagelo. A causa del peso de estas gotas, los flagelos pueden sufrir lesiones.

2. MATERIAL NECESARIO

-    Semen de conejo (Orictolagus cuniculus) con espermatozoides vivos diluido con   glucosa para su supervivencia.

-          Semen de conejo por espermatozoides fijados con glutaraldehído

-          Vagina artificial para favorecer la eyaculación del conejo

-          Pipeta Pasteur

-          Tubo de muestra y papel de aluminio

-          Túbulo cónico con tapa

-          Microscopio óptico

-          Portaobjetos y cubreobjetos

3. HIPÓTESIS INICIAL

Los espermatozoides de conejo presentan cabeza con forma alargada y colas con longitud del triple de esta. La pieza intermedia del espermatozoide se diferencia claramente. A la vista del microscopio, el movimiento de los espermatozoides es fluido y relativamente rápido. Algunos espermatozoides presentan anomalías.

4. OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA

Conocer el medio de trabajo en laboratorio en un ambiente más profesional como es el de una universidad.

Aprender sobre las características físicas y funcionales de los espermatozoides.

Observar aumentados los espermatozoides de conejo, tanto vivos como fijados.

Conocer el método de extracción de esperma en conejos.

Trabajar en las máximas condiciones de higiene posibles.

Manejar con delicadeza el microscopio a la hora de enfocar a gran cantidad de aumentos.

5. MÉTODO DE EXPERIMENTACIÓN

1.      Se extrae el esperma del conejo mediante la vagina artificial (calentada previamente a 40ºC para su desinfección) por presión en el glande.

2.      Parte del semen se diluye con glucosa (para conservar los espermatozoides vivos) y otra con glutaraldehído (para fijar los espermatozoides y realizar el conteo).

3.      Se introduce el semen con espermatozoides fijados en un tubo cónico con tapa.

4.      Con la pipeta Pasteur, se coloca una gota de semen en el portaobjetos y se cubre la muestra con el cubreobjetos.

Paso 4

5.      Del tubo de muestra con semen y glucosa, se extrae otra gota con otra pipeta Pasteur y se coloca en el mismo portaobjetos, tapándola con otro cubreobjetos.

6.   Se observan las muestras a 40 y 100 aumentos de objetivo, se fotografían los resultados y se calculan las proporciones de espermatozoides normales y con anomalías.

6. OBTENCIÓN DE RESULTADOS

Espermatozoides de conejo a 10x ocular y 40x objetivo

Espermatozoides de conejo a 16x ocular y 40x objetivo

Espermatozoides de conejo a 10x ocular y 100x objetivo

Espermatozoides de conejo en movimiento. 1ª parte: 400x; 2ª parte: 1000x

7. ANÁLISIS DE RESULTADOS

Después de la observación microscópica de los espermatozoides de conejo, se puede determinar que estos presentan una cabeza con forma ovalada-redondeada. La longitud de la cola es aproximadamente 5 veces la de la cabeza. Por lo que respecta al grosor, el de la cabeza es aproximadamente 4 veces el de la cola.

A causa de la calidad de los microscopios, no se pueden observar las mitocondrias de la pieza intermedia, el núcleo ni el acrosoma.

Tras la observación de 20 espermatozoides fijados con glutaraldehído, se han podido determinar las siguientes proporciones.

·  ANOMALÍAS DE CABEZA

MACROCEFALIA	MICROCEFALIA	CABEZA SUELTA	NORMAL
10% (2)	5% (1)	10% (2)	75% (15)

·  ANOMALÍAS DE COLA

COLA ENROLLADA	COLA PARTIDA POR GOTA CITOPLASMÁTICA	NORMAL
45% (9)	15% (3)	40% (8)

Espermatozoides con cabezas y colas normales: 25% (5)

Con respecto a los espermatozoides vivos, al estar sometidos a la temperatura de la luz del microscopio, estos nadan con un movimiento con tendencia rectilinia pero no fluido, similar a una vibración.

8. CONCLUSIONES

Los espermatozoides de conejo presentan una longitud de flagelo 6 veces mayor que la de la cabeza.

Un 25% de los espermatozoides no presenta ninguna anomalía de cabeza o cola.

El 40% de los espermatozoides de conejo está libre de anomalías de cola y el 75% de cabeza.

Los espermatozoides en un fluido con temperatura superior a 36º ven su forma de nadar alterada a causa del cambio de temperatura.

9. ERRORES DE LA PRÁCTICA

En un principio, se aplicó más cantidad de semen sobre el portaobjetos de la debida, por lo que la primera observación fue nula y la muestra se tuvo que repetir, quitando tiempo.

La cantidad de semen con espermatozoides fijados vertida fue inexacta, por lo que no se pudieron analizar las proporciones de espermatozoides con respecto a la cantidad de fluido.

No contamos con una medición exacta del tamaño de los espermatozoides.

Algunos espermatozoides en su transporte fueron dañados, por lo que se vieron cabezas y colas sueltas.

La luz provocó mucho contraste térmico respecto a la temperatura inicial de los espermatozoides, por lo que su movimiento se vio alterado.

El conteo de espermatozoides se realizó sobre un número muy bajo de espermatozoides, por lo que los resultados son orientativos y no demasiado concluyentes.

10. CONFIRMACIÓN O RECHAZO DE LA HIPÓTESIS

La longitud del flagelo del espermatozoide es superior a la esperada. Por otra parte, la cabeza no tiene forma alargada, sino ovalada. No se diferencia la pieza intermedia y el movimiento, a causa del aumento de temperatura, no es fluido, aunque sí rápido. No sólo algunos, sino gran parte de los espermatozoides tienen anomalías de cola y cabeza, en concreto el 75%.