HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN CON AMILASA. ¿Y DESNATURALIZADA?

1. INTRODUCCIÓN TEÓRICA

El almidón es un polisacárido compuesto por moléculas de glucosa (hexosas), unidas por enlaces glucosídicos.

Para facilitar la digestión de este polisacárido, la saliva contiene la amilasa, una enzima hidrolasa que cataliza la reacción de hidrólisis (realizada por el agua), rompiendo los enlaces glucosídicos del almidón. En el caso de este polisacárido la reacción la lleva a cabo concretamente la amilasa tipo ptialina. La amilasa se fabrica en el páncreas, además de en las glándulas salivales.

Reacción de la amilasa

La amilasa, por tanto, es una enzima (es decir, formada por proteínas), cuya acción hidrolizante de polisacáridos se produce a unos 37ºC en un medio de pH neutro con una salinidad determinada.

Por otra parte, el Lugol es un reactivo que contiene yoduro potásico y yodo molecular. Este último reacciona con el almidón formando cadenas de poliyoduro. La reacción se describe de la siguiente forma:

Los reactivos de Fehling A y B detectan azúcares reductores, como la glucosa, fructosa o sacarosa. En el caso de la glucosa, al contactar con el reactivo, reduce el sulfato cúprico que forma el reactivo de Fehling (junto con agua destilada, sal de Seignette e hidróxido de sodio), a óxido de sodio, quedando una solución de color rojo.

2. MATERIAL NECESARIO

- Saliva humana

- Almidón

- Ácido cítrico

- Ácido acético

- Bicarbonato sódico

- Cloruro sódico

- Agua

- Bolsa de hielo

- Hornillo de laboratorio

- Vaso de precipitado

- Vidrio reloj

- 11 tubos de laboratorio

- Cuchara de laboratorio

- Rotulador permanente

- Gradilla

- Báscula

- Pipetas con capacidad de 5mL y 10mL

- Propipeta

- Pipeta Pasteur

- Pinza de laboratorio

- Lugol

- Reactivo de Fehling A y B

- Pocillo

Parte del material necesario (arriba: almidón, cuchara, vidrio reloj, báscula, vaso de precipitado, gradilla y tubos; abajo: almidón y lugol)

3. HIPÓTESIS INICIAL

La enzima amilasa de la saliva (disuelta en agua) degradará el almidón (también disuelto en agua), haciendo que de este sólo queden moléculas de glucosa sueltas, con las que reaccionará el reactivo de Fehling A y B, provocando que en la disolución se produzcan cambios físicos. No obstante, si se desnaturalizan las proteínas de la amilasa mediante cambios bruscos de temperatura, en la acidez o en la salinidad, el almidón no se somete a la lisis enzimática, quedando íntegro. Por ello, con esa disolución reaccionará el lugol, produciendo también cambios físicos.

4. OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA

Aprender sobre las reacciones del Lugol con el almidón y el reactivo de Fehling con la glucosa.

Descubrir cómo la amilasa degrada el almidón y qué pasa si esta se desnaturaliza.

Manejar instrumental de laboratorio con precisión.

Trabajar con diversos productos químicos y disoluciones para las desnaturalizaciones.

Observar los resultados para sacar conclusiones sobre las desnaturalizaciones a partir de las reacciones.

5. MÉTODO DE EXPERIMENTACIÓN

1. Se lavan las manos, se colocan los guantes y la bata y se prepara el material.

2. Se disuelve saliva con agua, pipeteando 1mL en el tubo 1 y 2,2’,3,3’,4,4’,5 y 5’ y 0,5mL en los tubos 6 y 6’.

3. Se prepara una disolución de bicarbonato sódico en agua al 30% y se pipetea 1mL de esta a cada uno de los tubos 3 y 3’, además de 1mL de ácido cítrico.

Ácido cítrico (paso 3)

4. Se añade 0,5g de NaCl a los tubos 4 y 4’.

5. Los tubos 5 y 5’ se someten a cambios en la temperatura, pasando de un medio frío (bolsa con hielo durante 2 minutos) a un medio caliente (baño María a 37ºC durante 1 minuto).

Baño María de los tubos 5 y 5'

Tubos 3, 5 y 4 (con sus tubos').

6. Se añade 0,5mL de ácido acético a los tubos 6 y 6’.

7. Midiendo con la báscula, se vierte 0,75g de almidón en un vidrio reloj y se mezclan con 15mL de agua, dando lugar a una disolución de almidón al 10%.

Paso 7

8. Se vierte 1mL de la disolución de almidón en cada uno de los tubos, calentando a 37ºC el 1, 2 y 2’ (el primero al baño María) durante 3 minutos.

Paso 8

9. Se vierte en los tubos 2,3,4,5 y 6 1mL de yodo Lugol (en el 1 0'2mL) y en los tubos 1’,2’,3’,4’,5’ y 6’ 0,5mL de Fehling A y 0,5mL de Fehling B.

Extracción de Lugol para la reacción con el tubo 1 (paso 9)

10. Se calientan los tubos durante 1min al baño María para acelerar la reacción.

11. Se observan los resultados y se extraen conclusiones.

6. OBTENCIÓN DE RESULTADOS

Tubo 1 después de la reacción Lugol-Almidón

Tubos 2-6 después de la reacción con lugol.

Estado incial de los tubos 2'-6' con reactivo de Fehling A y B

Estado final de los tubos 2'-6' después de 1min al baño María.

7. ANÁLISIS DE RESULTADOS

Teóricamente, el lugol al reaccionar con el almidón da lugar a un color morado (marrón oscuro si la reacción no se ha completado). Por su parte, la mezcla de Fehling A y B da lugar a un color amarillo (azul verdoso si la reacción no se ha completado).

Se pueden observar los siguientes resultados:

TUBO	CONTENIDO	REACCIÓN	COLOR
1	1mL Almidón en H2O 10%	Lugol (1mL)	Morado
2	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O	Lugol (1mL)	Marrón Translúcido
2’	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O	Fehling A y B (0,5mL de cada)	Azul verdoso
3	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O 0,5mL ácido cítrico 0,5mL NaCO3 en H2O 30%	Lugol (1mL)	Morado – Marrón oscuro
3’	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O 1mL ácido cítrico 1mL NaCO3 en H2O 30%	Fehling A y B (0,5mL de cada)	Amarillo
4	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O 0’5g NaCl	Lugol (1mL)	Marrón transparente
4’	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O 0,5g NaCl	Fehling A y B (0,5mL de cada)	Azul verdoso
5	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O Cambios bruscos en temperatura	Lugol (1mL)	Marrón transparente
5’	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O Cambios bruscos de temperatura	Fehling A y B (0,5mL de cada)	Marrón translúcido
6	1mL Almidón en H2O 10% 0’5mL saliva disuelta en H2O 0’5mL ácido acético	Lugol (1mL)	Morado
6’	1mL Almidón en H2O 10% 0’5mL saliva disuelta en H2O 0’5mL ácido acético	Fehling A y B (0,5mL de cada)	Azul

Destacar que los colores en los tubos’ (excepto el 3’) al reaccionar con los reactivos de Fehling A y B eran inicialmente azules, pero al acelerar la reacción mediante 1 minuto al baño María (37ºC) los colores tendieron a verde (excepto el 6’).

Se pueden observar los siguientes resultados.

Tubo 1: El lugol reacciona con el almidón, al no haber estado hidrolizado.

Tubo 2 y 2’: El almidón está hidrolizado al no presentar desnaturalizaciones la amilasa, por eso el Fehling tiene tendencia a reaccionar y el lugol no.

Tubo 3 y 3’: Ambos tubos presentan reacciones: lugol con almidón y Fehling con glucosa, por lo que se concluye que parte del almidón ha sido hidrolizado y parte no (al no haber sido completamente desnaturalizada la amilasa).

Tubo 4 y 4’: La amilasa no ha sido desnaturalizada, por lo que ha degradado el almidón. Por ello reacciona parcialmente el Fehling y el lugol no.

Tubo 5 y 5’: La amilasa no ha sido desnaturalizada, por lo que ha degradado el almidón. Por ello reacciona el Fehling y el lugol no.

Tubo 6 y 6’: La amilasa ha sido correctamente desnaturalizada, por lo que el almidón no se ha degradado. El lugol reacciona y el Fehling no.

Las posibles causas de las desnaturalizaciones fallidas aparecen en el apartado 9)Errores de la práctica.

8. CONCLUSIONES

El ácido acético es capaz de desnaturalizar la amilasa salival para que esta no degrade el almidón.

El lugol produce una reacción al detectar el almidón, volviéndose de color morado; al contrario que el reactivo de Fehling A y B, que reaccionan con la glucosa, tornándose de color amarillento (aunque si estuviera totalmente hidrolizada sería rojo).

La amilasa es una enzima que degrada el almidón, rompiendo los enlaces glucosídicos y separándolo en moléculas sueltas de glucosa.

9. ERRORES DE LA PRÁCTICA

Los fallos en la desnaturalización de las proteínas de la amilasa se pueden producir a las siguientes causas:

-          Desde las desnaturalizaciones hasta las reacciones finales pasaron dos semanas.

-          En los tubos 3 y 3’, aparte del vaso de precipitado inicial con la disolución de almidón, aparecieron hongos a causa del incorrecto aislamiento.

Aunque se intentó precisión mediante báscula y pipetas, algunas medidas no fueron del todo exactas y hubo errores en ellas.

No se utilizaron las medidas de seguridad e higiene pertinentes en todo momento.

10. CONFIRMACIÓN O RECHAZO DE LA HIPÓTESIS

La enzima amilasa de la saliva efectivamente degrada el almidón, haciendo que las moléculas de glucosa queden sueltas, por lo que el reactivo de Fehling A y B reacciona, quedando un fluido de color amarillento, pero si la reacción continuara se tornaría rojo. Si se desnaturalizan correctamente las proteínas de la amilasa (de forma comprobada mediante ácido acético), el almidón no se hidroliza, por lo que efectivamente reacciona con el lugol, de forma que se queda un fluido morado.