EXTRACCIÓN DEL ADN DE TOMATE
1. INTRODUCCIÓN
TEÓRICA
El ADN, ácido desoxirribonucleico, es un ácido nucleico
presente en todos los seres vivos y que contiene toda la información de ellos,
además de las instrucciones para la síntesis de proteínas en el interior de las
células.
En organismos eucariotas, la fibra de ADN se ubica en el
interior de la membrana nuclear, mientras que en los procariotas se encuentra
en medio del citoplasma, con pequeños fragmentos sueltos llamados plásmidos que
aportan características ventajosas.
Una molécula de ADN presenta la siguiente estructura:
Ya que existe una copia idéntica de este material genético
en todas las células de los organismos pluricelulares, cuando estas se dividen
es necesario hacer una copia idéntica del ADN para cada célula hija. La cadena
de ADN se separa y se hace una copia complementaria de cada una de las dos
partes, idéntica a la otra. Cabe destacar que en esta replicación no deben
haber fallos, ya que si la correspondencia de las bases nitrogenadas (Adenina-Timina
y Guanina-Citosina) se altera, se produce una mutación, que puede conducir a
cambios en el organismo a causa de una síntesis errónea de proteínas.
Para sintetizar proteínas, se emplea el ARN, ácido
ribonucleico, con la misma estructura del ADN pero con la pentosa ribosa en
lugar de la desoxirribosa y la base nitrogenada uracilo en sustitución de la
timina, también complementario a la adenina. El ARN mensajero hace una cadena
complementaria de una de las hélices, para luego trasladarla a los ribosomas,
donde el ARN transferente selecciona aminoácidos para conformar proteínas a
partir de la información de las bases nitrogenadas. Por ello, si en el ADN del
que se ha hecho la copia hay un error, los aminoácidos pueden ser mal
seleccionados.
Volviendo al tema de la división celular, cuando el ADN se
ha replicado, este (extendido en fibras de cromatina) se enrolla alrededor de la proteína histona para formar
cromosomas. En la especie humana, existen 23 pares de cromosomas. Cada par
contiene la información que determina ciertos caracteres y está conformado por
un cromosoma del padre y otro de la madre del individuo. Ya que cada cromosoma
contiene la misma información duplicada, este presenta dos cromátidas antes de
la división.
La división consiste en la condensación del ADN y rotura
de la membrana nuclear (profase); la colocación de los cromosomas en el eje
central de la célula (metafase); la separación de las cromátidas de cada
cromosoma estiradas por los hilos del huso acromático, que parte del centrosoma
(anafase); y la formación de las nuevas membranas nucleares y descondensación
del ADN en cada célula hija (telofase).
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| Cariotipo humano: cromosomas duplicados antes de la división celular |
Como técnica de laboratorio, con el fin de amplificar un
fragmento de ADN, obteniendo millones de copias de este, y determinar cadenas
genéticas, se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa o PCR. En
agronomía, esta técnica se utiliza para determinar los individuos con mayor
resistencia a plagas, para favorecer su reproducción y la perpetuación de estas
características ventajosas, que son identificables gracias a trazas que
aparecen en el ADN ampliado.
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| Resultado de una PCR |
2. MATERIAL
NECESARIO
-
Hoja
de tomatera (Solanum lycopersicum)
-
Papel
de filtro
-
Pequeño
mazo de plástico
-
Tubos
cónicos con tapa
-
Gradilla
-
Pipeta
automática con capacidad máxima de 500mL
-
Pipeta
automática con capacidad máxima de 200mL
-
Puntas
de plástico con forma cónica para cada pipeta
-
Rotulador
permanente
-
Centrifugadora
-
Incubadora
-
Vaso
de plástico (papelera)
 |
| Material empleado |
Compuestos químicos utilizados para la extracción del ADN
y sus funciones.
Tampón de extracción: favorece la lisis de las células.
-
Tris(hidroximetilaminometano):
mantiene el pH estable.
-
EDTA
(ácido etilendiaminotetraacético): inhibe las enzimas ADNasas, que pueden dañar
el material genético.
-
NaCl:
al neutralizar la carga de los grupos fosfatos, insolubiliza el ADN en alcohol.
-
SDS
(detergente): degrada el núcleo (ya que este es graso) para poder liberar el
ADN.
-
Acetato
de potasio: favorece la precipitación de proteínas y de otros restos celulares,
pero no del ADN.
-
Isopropanol:
ya que el ADN ahora es insoluble en él, ayuda a que precipite.
-
Acetato
de sodio: favorece la precipitación del ADN.
-
3. HIPÓTESIS
INICIAL
Al someter a la hoja de tomatera a procesos químicos con
compuestos relativamente profesionales, su ADN se podrá observar en finas
hebras translúcidas en suspensión en el agua.
4. OBJETIVOS DE LA
PRÁCTICA
Conocer datos sobre el Ácido desoxirribonucleico.
Aprender acerca de la técnica de laboratorio PCR.
Manipular distintos tipos de compuestos químicos
(aprendiendo las funciones de cada uno en la extracción del ADN) con
instrumental preciso.
Observar físicamente el ADN extraído.
Familiarizarse con el ambiente de trabajo de laboratorio.
5. MÉTODO DE
EXPERIMENTACIÓN
1.
Se
lavan las manos y se coloca el material necesario sobre el espacio de
laboratorio.
2.
Se
rotulan con los nombres los tubos cónicos con tapa vacíos.
3.
De
una parte del tallo de tomatera se extrae una hoja (a poder ser de los brotes)
y se introduce en el tubo cónico.
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| Paso 3 |
4.
Con
la pipeta automática se extraen 250μl del tampón de extracción (formado por el Tris, EDTA y
NaCl) y se vierten en el tubo cónico con la hoja de tomatera.
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| Paso 4 |
 |
| Paso 4 |
6.
Con
la pipeta con capacidad máxima de 200μl se añaden 35μl de SDS al tubo cónico.
7.
Se
cierra la tapa, se agita y se incuba a 65ºC
en la incubadora durante 5min.
8.
Con
la punta de la pipeta cambiada, se añaden 130μl de Acetato de potasio a la muestra y se incuba 5min a temperatura
ambiente.
9.
Para
purificar el ADN, se centrifuga la muestra a 13000rpm durante 10min. Cabe
destacar que la cantidad de tubos cónicos debe ser igual en paralelo para
evitar diferencias de peso.
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| Paso 9 |
10. Con la pipeta de 500μl con punta nueva se extrae el máximo
posible del sobrenadante (en este se encuentra el ADN), evitando coger el
precipitado.
11. Se vierte el sobrenadante en otro
tubo cónico y se desecha el precipitado sobrante en el primer tubo.
12. Con una pipeta se echa 500μl de isopropanol en el tubo del sobrenadante
y, con la otra, 60μl
de Acetato de sodio.
13. Se incuba la muestra 10min a
temperatura ambiente y se centrifuga a 12500rpm durante otros 10min.
14. Ya que el ADN ha precipitado, se
elimina el sobrenadante.
15. Se añade con la pipeta 300μl de etanol al 70% a la muestra y
se golpea ligeramente para la desadherencia del ADN de las paredes del tubo.
16. Se centrifuga durante 5min a
12500rpm.
17. Se limpia el espacio de trabajo.
6. OBTENCIÓN DE
RESULTADOS
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| Hoja triturada y mezclada con el TRIS. |
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| ADN (color marrón) extraído, flotando en el etanol. |
7. ANÁLISIS DE
RESULTADOS
Tras poner la hoja de tomate bajo los efectos de distintos
compuestos químicos, incubaciones y centrifugación, el ADN se observa
precipitado en el fondo del tubo cónico. El ADN extraído presenta un área
aproximada de 1 mm2, una forma irregular y color marrón. Cabe destacar que la
hoja de la que se ha extraído tenía un área aproximada de 20mm2.
8. CONCLUSIONES
Tras someter una hoja de tomatera a procesos físico-químicos,
se puede observar su ADN precipitado.
El ADN de una pequeña hoja de tomate presenta 1/20 de su área
y un color marrón.
9. ERRORES DE LA
PRÁCTICA
El material no estaba esterilizado.
No se usaron guantes ni bata.
Algunas de las cantidades extraídas y vertidas mediante la
pipeta no fueron exactas, ya que accidentalmente se introdujeron burbujas de
aire.
No se midió el peso de la hoja de tomatera de la que se
extrajo el ADN.
Los tiempos no fueron exactos.
Faltó tiempo para desarrollar la práctica, por lo que
algunos tiempos de incubación fueron menores de lo esperado.
10. CONFIRMACIÓN O
RECHAZO DE LA HIPÓTESIS
En contraposición a las fibras translúcidas del ADN que se
esperaba extraer, el resultado dio una porción “compacta” de 1mm2 de material
genético. De este modo, la densidad del ADN extraído es mayor a la del etanol,
por lo que el material genético tiende a bajar, y no a estar en suspensión. No
obstante, la cantidad que se esperaba obtener era aproximadamente la misma a la
obtenida.
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